“民以食为天”，中国饮食文化博大精深，食品种类丰富多样，而“食以安为先”，食品安全问题越来越成为大家热议的话题。
研究背景
据世界卫生组织统计，全世界每年报告的食源性疾病达 6 亿例，其中 70% 的病例是由被各种致病微生物污染的食物和水引起的。仅 2010 年，就有 42 万人死于沙门氏菌和大肠杆菌感染等疾病，其中三分之一是五岁以下儿童。根据中国疾病预防控制中心（CDC）统计，2020 年，我国共报告了 7073 例食源性疾病暴发事件。
食源性疾病常见的病原有痢疾杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠杆菌等细菌。食源性疾病主要流行特征为：食物传播、散发性、地区性、季节性、发病突然、病例集中，常以家庭、学校、幼托等集体性食物中毒形式出现。
如何及时、准确鉴定食源性致病微生物成了食品安全领域研究的重点，相关的检测技术这些年也在飞速发展中，目前已经有包括传统培养法、免疫学、分子生物学检测等在内的多个检测方法。
食品微生物检测方法
Food Testing
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传统培养法 |
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原理 |
基于微生物形态学和培养特性为评价标准的方法 |
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优点 |
准确性和灵敏度较高 |
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缺点 |
1. 流程繁杂、检测时间长（4-7 天） 2. 效率不高，一次检测不能针对所有菌种 |
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分子生物学快速检测技术 |
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原理 |
聚合酶链式反应（PCR）技术为主，使目的 DNA 得以迅速扩增，达到可以检测的水平 |
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优点 |
检测时间短、灵敏度高、特异度强 |
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缺点 |
需要升降温过程，对仪器和人员要求高 |
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免疫学技术 |
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原理 |
利用抗原抗体间特异性结合的基本原理进行微生物检测 |
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优点 |
高灵敏度、操作简单 |
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缺点 |
实验灵敏度和特异性依赖于抗体的好坏 |
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生物传感器 |
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原理 |
新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一种新技术，可以借助于新型纳米材料将生物响应信号转化为其他信号 |
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优点 |
检测准确、操作简单 |
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缺点 |
灵敏度低、易受杂质干扰，需要进一步深化研究与技术方法改进 |
PCR & 食源性致病微生物检测
PCR Tech
虽然检测手段已经日渐丰富，但是综合预期目标的精确性、检测时间、经济性、操作简便性、技术服务等因素，PCR 技术是目前现代食源性致病微生物检测的主力方法。
PCR (Polymerase Chain Reaction) 全称为聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法。由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的 DNA 得以迅速扩增，达到可以检测的水平。
今天的莫纳课堂就来为大家详细讲讲：如何利用 PCR 技术进行食源性致病微生物检测。
以国标（GB4789. 6 — 2016）中对于致泻大肠埃希氏菌的检测为例。在传统生化试验的基础上，进一步选取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行 PCR 确认试验。
* 致泻大肠埃希氏菌检验程序
01
体系配置
PCR 反应体系包括多种组分：模板、引物、酶、dNTP，Mg2+、缓冲体系。可以逐一添加单个组分，也可以选择预混液或试剂盒来完成实验。
2×通用型PCR预混液（含染料）（MP22101）
极广的模板引物适应性：针对复杂模板，抑制物模板，有极高的PCR成功率
长片段扩增：最长可扩增 10 kb DNA 片段
灵敏度高：低至 10 pg
扩增速度：15s/kb
Mix 中已预加蓝色染料，后续可直接进行凝胶电泳
每次 PCR 反应使用五种致泻大肠埃希氏菌 EPEC 、 EIEC 、 ETEC 、 STEC / EHEC 、 EAEC 标准菌株作为阳性对照。同时，使用大肠埃希氏菌 ATCC 25922 或等效标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照，来控制 PCR 体系污染。
五种致泻大肠埃希氏菌目标基因引物序列及每个 PCR 体系内的终浓度国标中已经说明，操作者按照标准进行引物的合成与添加即可。对于 PCR 反应体系，如使用单一组分进行体系配置，需按照国标中的扩增体系配制表进行配置，如使用商品化 PCR 试剂盒或多重聚合酶链反应( MPCR )试剂盒，则按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。
02
PCR反应
PCR 实验需要借助的设备就是我们所说的 PCR 仪。PCR 仪又叫 PCR 基因扩增仪，是利用 PCR 技术对特定 DNA 扩增的一种仪器设备。根据国标中规定的反应条件或者试剂盒说明的条件进行程序的设置。
莫纳 Arhat 96梯度PCR仪（MP60101）
用于常规 PCR 实验
96×0.2/0.1 ml
专利复合式冷却系统（专利号：201821052750.3，实用新型专利），反应温度均一、准确
专利消蒸模块（专利号：201920162941.3，实用新型专利）、防止边缘蒸发现象
特殊结构设计，可叠放、可近距离摆放、节省空间
03
结果判断
PCR 反应结束后需要进行琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果来进行最终结果的判定。
电泳结果中空白对照应无条带出现，阴性对照仅有 uidA 条带扩增，阳性对照中出现所有目标条带，PCR 试验结果成立。根据电泳图中目标条带大小，判断目标条带的种类，记录每个泳道中目标条带的种类，在表中查找不同目标条带种类及组合所对应的致泻大肠埃希氏菌类别。
* 五种致泻大肠埃希氏菌目标条带与型别对照表
莫纳相关产品推荐
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货号 |
产品名 |
规格 |
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MP60101 |
Arhat 96梯度PCR仪 |
1/set |
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MP22101S |
2×通用型PCR预混液（含染料） |
5×1 ml |
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MP72001M |
96孔PCR板，200 μl透明，无裙边，单切角（H1) |
10 pk |
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MP71001M |
透明PCR粘性封板膜 |
2×50 Sheets |
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GT20102S |
恒温金属冰盒（莫纳蓝，组合套装） |
1/set |
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ME00101S |
高纯度琼脂糖 |
100 g |
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ME20201S |
安全核酸染料 Safe Red |
500 μl |
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ME40601S |
D2000 DNA 分子量标准 |
500 μl |
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ME60101 |
MM-DNA 中型水平电泳槽 |
1/set |
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PE60101 |
Basic-P 基础电泳仪电源 |
1/set |
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GD50102 |
QuickGel 6200 凝胶成像系统 |
1/set |
